体外诊断试剂研发包被标记检测等详细步骤注意点影响因素
一、抗体包被详细步骤：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/mL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL，4℃过夜。次日，平衡至室温弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次1分钟。加入封阻液200uL，37℃温浴2-3h，用洗涤缓冲液洗3次，每次1分钟。加入200uL含5%蔗糖的PBS缓冲液，37℃温浴1h，甩干后37℃烘干1h后自封袋封存（含干燥剂）。
包被缓冲液：
10mM PBS; pH 7.4
20mM Tris-HCL； pH7.2-8.0
50mM 碳酸盐缓冲液； pH 9.6
洗涤缓冲液：10mM PBST(含有0.05%吐温) pH 7.4
封阻液： 10mM PBS缓冲液 ph7.4，含1%BSA
二、过碘酸钠氧化法标记步骤：称0.5mg HRP，溶于0.25ml纯化水，入20uL新配的0.1M NaIO4，室温避光反应20min（15-30min）。1mM 醋酸钠缓冲液透析，4度过夜，加入50ul 0.16M 乙二醇，混匀静置30min，加入5ul 0.2M CBS。立即加入0.5mg抗体，室温避光轻混2-4h，加入10ul新配的4mg/ml NaBH4，4度避光2h。对PBS透析过夜调浓度，甘油对半稀释，-20冻存。
三、具体操作步骤
1.配制稀释液（PBS，pH7.2～7.4，含2%BSA）；
2. 取1块预包被板，平衡至室温（大概时间20min）；
3. 取CA125抗原一支（冻干品，500U/支0.5mL纯水复溶）复溶混匀；
4.加入稀释液，配制浓度为12U/mL，50U/mL的抗原液作为校准品；
5.将-20℃酶标抗体（冻存浓度为500ug/mL）室温快速溶解（可以用手温或37℃水浴溶解），加入稀释液中，酶使用浓度为1ug/mL
6.酶反应底物配置，完成后用锡箔纸避光，使用之前必须平衡至室温（至少20min）
7.所有试剂使用前平衡至室温（大概20min，液体较多则平衡至30min）
8.每个孔加样100ul（垂直悬空加入，切勿碰到孔壁）盖上封板膜37℃孵育1h，和90min，注意边缘效应，边缘数值一般较高；
9.沿弧线甩干液体，移液枪小心加入300uL PBST（0.05%吐温）洗涤液，不要流出孔外，放置到微量振荡器振荡1min，重复洗涤四次。最后一次甩干液体，并用吸水纸拍干，注意吸水纸和板孔之间不要挪动出现试剂交叉污染，尤其拍干第一次立即更换吸水纸
10.每孔加入100ul稀释过的酶标抗体，注意悬空和切勿触碰孔壁，操作与步骤7相同。盖上封板膜37℃孵育1h和90min。
11.洗涤与拍干（操作与步骤8 相同）
12.加入100uL底物（悬空勿碰壁）
13.室温放置3min，检测
四、包被标记检测注意点：
1. IgG-FC与聚苯乙烯结合主要是在FC片段，可以直接包被，但是如果抗原决定簇在疏水区域则 不能用于直接包被。
2.结合物的保存：结合物由于含有酶同时抗体也是蛋白在常温不稳定，应低温存储，短期使用可以放置4℃。-20℃存储时避免反复冻融，应加入等体积的甘油同时加入蛋白冷冻保护剂，抗生素，防腐剂等。重要是甘油的比例必须是等体积混合。
3.结合：结合的方式主要有戊二醛和过碘酸钠二种，戊二醛是一种双功能团试剂，可以通过醛基和蛋白质的氨基结合分为两步法和一步法，一步法的缺点是结合物不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也会发生结合故一般不适用。过碘酸氧化法适用于含糖的酶的标记，糖酶氧化形成醛基通过与抗体氨基结合，其中酶应该过量比例为1-2/1。酶结合物的浓度确定不应过高或过低，过高不经济同时本底增加，过低虽然得到较低本地但是影响检测的敏感性，必须是较低的本底同时拥有最佳的灵敏度。
4.抗原的包被缓冲液中不能含有表面活性剂，应该透析去除。
5.分离血清时不能放置4℃，否则将出现IgG，IgM失活。
五、包被标记检测影响因素：
1.包被：包被与蛋白的分子量有关，分子量大疏水区域多，结合作用力强。还与等电点，pH，包 被温度有关，包被温度低，结合速度慢，结合作用力强，结合量多。等电点附近蛋白不带电荷，疏水作用增强，由亲水胶体变为疏水胶体，更容易结合。缓冲液中加入一定浓度盐离子有利于结合，盐离子能中和电荷减少斥力。
2.抗原：抗原分为天然抗原，重组抗原，合成抗原。合成抗原纯度高，特异性好，但是分子量小，只有一个或者少数几个抗原决定簇，只能与其他蛋白结合使用，由于某些微生物抗原已发生突变，所以可能出现漏检。抗原浓度过高则低效价的抗体检测不出，或者出现多层吸附，故可在操作中洗脱降低多层吸附降低灵敏度。
3.抗体：天然IgG抗体的主要来源为抗血清，含有单克隆抗体的腹水，或者培养液。抗体的使用一般要纯化：一般使用的血清直接用硫酸铵沉淀后，过琼脂糖凝胶柱，如果需要更纯的抗体，则要经过亲和层析。
4.包被条件：包被缓冲液一般10mMPBS,pH7.4；碳酸盐缓冲液，pH9.6；Tris缓冲液pH7-8
。包被条件一般为4℃，过夜；或者37℃，2h，理论上应该低温包被效果更好。包被的浓度应该通过酶浓度和反应体系协调选定。通过比较灵敏度，零值，医学决定水平，高值，低值来确定。
5. 封闭；好的封闭剂如BSA，血清，明胶等，可以同时使用。主要通过填补结合的空隙，防止血清物质的干扰。好的封闭剂一般可以让零值的RLU降低在5000以下，同时灵敏度提高。
6.酶：用于标记的酶必须纯度高，专一性强，来源简单，价格便宜。HRP酶：糖蛋白，含糖
18%，分子量44kd，等电点为pH7.2，由主酶（酶蛋白）275nm和辅基（铁卟啉（E 铁血素）403nm）组成，酶的纯度用RZ表示，RZ>9.0为高纯度蛋白。AP酶由大肠杆菌制备，或者小牛肠膜提取，大肠杆菌制备蛋白80kd，分子量相比HRP比较大，最适PH为8.0。小牛肠膜提取蛋白分子量为100kd，最适pH为9.6。不同的酶选用不同的底物，HRP酶分子量小，易于结合，而具有广泛的应用。
7.材料：目前常用的包被材料有聚苯乙烯，聚氯苯乙烯，塑料管。使用前必须对材料进行板子鉴定：取0.2ug/mL正常人IgG抗体包被，一般认为全板中每孔间OD值相差10%以下，阴性阳性样品对照结果相差10倍以上才可以算是合格。
8. 试验样品：血清的应在24h内使用，不用应分装放在低温并防止反复冻融。血清中的血红蛋白高会出现假阳性，微生物污染（酶分解和酶污染）也会出现。血清应该充分凝固，血清中的纤维蛋白会出现假阳性结果。
9.酶结合物稀释度：抗人酶结合物则用1ug/mLIgG包被，确定反应体系影响因素稀释条件，与不同酶浓度棋盘测定，根据零值，医学决定水平，高值，低值和灵敏度来确定各稀释度和浓度。
10.稀释剂和洗涤剂：加入封阻剂（0.5%-1%BSA）填补空白吸附位置，避免血清物质的非特异性吸附和吐温-20（0.05%）提高特异性吸附阻止非特异性物质的吸附。稀释剂如果采用pbs缓冲液，则可以加入0.2%KCl。0.5MNaCl和2-10%血清加入稀释剂中可以提高特异性。
